甲胎蛋白（AFP）與人血清白蛋白的結構對比分析

目前對AFP的研究主要集中在其作為腫瘤/妊娠標志物的作用及其細胞生物學(xué)功能，而對AFP蛋白結構和性質(zhì)的研究近年來(lái)較少關(guān)注。對甲胎蛋白結構的直接觀(guān)察始于1983年，Luft等人將暗場(chǎng)電子顯微鏡與激光輔助光學(xué)系統相結合，獲得了人甲胎蛋白分子的“V”形圖像。圓二色、熒光光譜、掃描微量熱等技術(shù)已被用于研究AFP的二級結構和構象，以及其蛋白質(zhì)性質(zhì)，如穩定性和配體結合。Vladimir N. Uversky的實(shí)驗結果表明，AFP在各種條件下（如pH 4.5-10.5；低于70℃；低于2.0 M鹽酸胍或7.5 M尿素）具有很高的蛋白質(zhì)穩定性。雖然AFP的三維模型已經(jīng)被模擬和利用，但AFP的真實(shí)構象仍然難以捉摸。

研究人員利用HEK 293F細胞系制備了重組AFP，并利用單粒子冷凍電鏡（cryo-EM）成功地鑒定了其結構；詳細分析了其結構特征，并與人血清白蛋白（HSA）進(jìn)行了系統比較。

1. AFP結構分析

為了研究AFP的結構特征，研究人員通過(guò)HEK 293F懸浮細胞瞬時(shí)表達C端帶有2x Strep標簽的重組AFP。通過(guò)Western blotting確定獲得的蛋白為AFP蛋白（圖1c），尺寸排阻色譜和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測結果顯示重組AFP純度較高（圖1a，b），瞬時(shí)表達獲得的重組AFP蛋白可用于冷凍電鏡分析。

研究人員使用cryo-SPARC錄制和處理了不同狀態(tài)的AFP視頻（圖2a，b）。經(jīng)過(guò)運動(dòng)校正和對比度傳遞函數估計，根據0.143的金標準傅立葉殼相關(guān)性（圖2d和補充圖1），以3.31?的總分辨率生成了cryo-EM圖，顯示了良好的側鏈密度（圖2c）。這使得研究人員能夠為AFP建立精確的原子模型（圖2e）。

AFP具有心臟樣不對稱(chēng)形狀，尺寸為93.2 ?×83.3 ?×59.6 ?，體積為36030 ?³。在三維結構中觀(guān)察到全長(cháng)AFP具有信號肽（殘基1-18）和成熟蛋白（殘基19-609）。AFP主要由α-螺旋組成，約占其二級結構的69%，α-螺旋由環(huán)狀區域連接（圖2e和圖4）。AFP有三個(gè)結構域：I、II和III，進(jìn)一步細分為IA、IB、IIA、IIB、IIIA和IIIB亞結構域。這些亞結構域由4-6個(gè)螺旋組成，并產(chǎn)生潛在的配體結合位點(diǎn)（圖2e）。

AFP的提取和純化

圖1.AFP的提取和純化

注：a.甲胎蛋白的尺寸排阻色譜圖，AFP的洗脫峰為單峰，且對稱(chēng)，體積為2.12 mL。b.從尺寸排阻色譜組分中純化的AFP SDS-PAGE分析結果。當使用含有還原劑β-巰基乙醇的上樣液時(shí)，還原的AFP分子量約為85 kDa。非還原的AFP分子量約為70 kDa。c.純化的AFP Western blot分析結果；用Strep抗體進(jìn)行免疫染色。

AFP的冷凍電鏡分析

圖2.AFP的冷凍電鏡分析

注：a.從300kv Titan Krios顯微鏡上拍攝的冷凍水合AFP的原始顯微照片。b.典型的AFP二維平均值。c.密度圖對應的AFP原子模型。d.AFP的三維重建圖，分辨率為3.31 ?。e. AFP的整體冷凍電鏡結構。

hAFP冷凍電鏡分析

圖3.hAFP冷凍電鏡分析

注：a.低溫電鏡數據處理工作流程。b.最終hAFP三維密度圖的局部分辨率估計。c.三維細化后的金標準傅里葉殼相關(guān)曲線(xiàn)（FSC=0.143）。d.最后一次結構細化迭代中的粒子取向分布。e.歐拉角重構分布。

AFP與HSA序列比對

圖4.AFP與HSA序列比對

注：AFP具有代表性的二級結構元素顯示在序列上方。不變殘基和高度保守殘基分別用紅色陰影和紅色字母表示。參與二硫鍵形成的胱氨酸殘基用同樣的綠色數字表示。

2. AFP與HSA的結構比較

人血清白蛋白（HSA）是血漿中含量最多的蛋白質(zhì)，半衰期為19天。HSA主要在成人肝臟中合成，HSA的功能包括維持血管中的膠體滲透壓，調節血液pH值，在炎癥條件下作為自由基的清除劑，并參與凝血和傷口愈合等過(guò)程。HSA在運輸各種生物活性分子，包括蛋白質(zhì)、FA、激素、藥物和營(yíng)養物質(zhì)方面也起著(zhù)至關(guān)重要的作用。這些功能取決于HSA的結構特征，其內部結合位點(diǎn)和表面活性基團允許與許多生物分子相互作用并將其運輸到全身。由于其血清濃度高、半衰期長(cháng)、再循環(huán)頻繁、無(wú)毒、無(wú)免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，HSA被廣泛用作各種治療分子的遞送載體。

AFP和HSA都屬于白蛋白家族，在卵黃囊和胎兒肝臟中合成比例較高。在體內，AFP表現出與HSA相似的運輸功能，包括將母體營(yíng)養物質(zhì)（如二十二碳六烯酸）通過(guò)胎盤(pán)屏障運輸到胎兒，表明其作為藥物遞送載體的潛力。由于在某些癌細胞中存在特異性的AFP受體，AFP在癌癥治療的靶向藥物遞送方面比HSA更有潛力。

2.1 整體結構

HSA和AFP的氨基酸序列高度同源，整體結構非常相似。當比較AFP和HSA-棕櫚酸（PDB:1E7H）的整體結構時(shí)，結構域II幾乎完全重疊。HSA和AFP蛋白在249被修剪的原子對之間的RMSD為1.186 ?（所有571對原子間的RMSD為5.763 ?）。與AFP相比，HSA的結構域I更靠近蛋白的中心，亞結構域IIIA/B也更靠近彼此（圖5a）。與HSA類(lèi)似，AFP顯示出大量的二硫鍵，賦予結構穩定性。AFP具有32個(gè)半胱氨酸殘基，它們都參與了16個(gè)二硫鍵的形成。相比之下，AFP比HSA少3個(gè)半胱氨酸殘基和1個(gè)二硫鍵。有趣的是，除了第一個(gè)二硫鍵外，其余AFP的二硫鍵位置與HSA的位置相對應（圖5a）。分別比較AFP和HSA的子結構域，發(fā)現每個(gè)子結構域的構象幾乎相同（AFP的N端區域除外）。

2.2 FA結合位點(diǎn)

整體構象差異可能是由配體或底物的結合引起的。比較AFP和HSA的FA結合位點(diǎn)，發(fā)現HSA比AFP結合的FA數量更多，并且兩種蛋白之間有一些結合位點(diǎn)重疊（圖5b）。將AFP的4個(gè)FA結合位點(diǎn)與HSA中的相應位置進(jìn)行比較，AFP的FA結合位點(diǎn)2和4與HSA的FA結合位點(diǎn)6和5在結構上相似。參與FA結合的氨基酸殘基的性質(zhì)也相似。AFP的FA結合位點(diǎn)1與HSA結合位點(diǎn)hsa7相對應。兩個(gè)FA結合袋具有相似的構象。然而，在HSA IIA和IA之間的界面處存在額外的FA結合，并且FA羧基通過(guò)與Tyr150、Arg257和Ser287側鏈的氫鍵錨定在HSA亞結構域IIA中。在A(yíng)FP中，Arg257和Ser287被非極性氨基酸Gly281和Gly311取代，這使得FA更容易與AFP IIA結合而不是IIA-IA交叉區。AFP的FA結合位點(diǎn)3與HSA結合位點(diǎn)3、4相對應。

2.3 FA結合口袋

兩種蛋白結合袋的肽鏈骨架構象相似，但口袋大小不同。與AFP相比，HSA在亞結構域IIIA中與一個(gè)額外的FA結合位點(diǎn)。兩種蛋白與FA羧基相互作用的氨基酸殘基也不同。在HSA中，FA3與Ser342、Arg348和Arg485形成氫鍵，而FA4與Arg410、Tyr411和Ser489形成氫鍵。在A(yíng)FP中，FA羧基靠近Tyr435和Ser513；Glu474與Arg372、Ser408和Arg509形成氫鍵，導致Glu474側鏈的運動(dòng)穩定和受限。在HSA中，Pro384與AFP中的Ser408相對應，導致無(wú)法與Glu450建立氫鍵（與AFP中的Glu474相對應）。在FA存在時(shí)，HSA的Glu450側鏈發(fā)生了向外的構象波動(dòng)。AFP和HSA之間的這種結構差異導致AFP的結合袋尺寸相對較小。因此，FA占據了AFP中大部分的結合口袋，從而阻礙了其結合過(guò)量FA的能力。

與HSA不同，AFP的IB亞結構域不與FA結合。HSA與AFP之間參與FA結合的氨基酸性質(zhì)存在顯著(zhù)差異，如Val141（AFP）與Arg117（HSA）對應，Ala206/207（AFP）與Asp183（HSA）對應。比較這兩種蛋白質(zhì)在亞結構域上的差異，發(fā)現環(huán)的氨基酸組成發(fā)生了變化。與HSA相比，AFP在環(huán)中有兩個(gè)額外的氨基酸。兩個(gè)帶正電的精氨酸殘基（Arg114/Arg117）可能在HSA環(huán)中起重要作用。在A(yíng)FP中，這些殘基對應非極性氨基酸（Leu138/Val141）（圖5c），影響了結合袋的表面電荷和疏水性。因此，環(huán)的差異可能是這兩種蛋白質(zhì)在這個(gè)口袋中底物結合的決定因素。

2.4 子結構域

對AFP和HSA的所有子結構域進(jìn)行比較分析，發(fā)現兩種蛋白之間幾乎所有的子結構域都表現出相似的構象。IA亞結構域的構象差異主要集中在N端區域。AFP中的24個(gè)N端氨基酸（AA 19-42）形成一個(gè)環(huán)，其中來(lái)自另一個(gè)環(huán)的Cys37和Cys86形成一個(gè)二硫鍵（圖5c），穩定了兩個(gè)環(huán)的構象。此外，AFP的His22與來(lái)自IIA結構域的三個(gè)氨基酸一起與金屬離子形成四面體配位，進(jìn)一步增強了環(huán)結構的穩定性。相比之下，HSA的N端氨基酸形成α螺旋，與其他螺旋一起形成一個(gè)小的疏水口袋。HSA FA2鏈尾部與這個(gè)口袋結合，其羧基錨定在結構域IIA上（圖5c）。因此，FA與HSA結構域I的結合使得結構域I相對于結構域II旋轉，從而促進(jìn)了連續疏水口袋的形成。這是HSA表現出更緊湊的整體構象的原因之一。

AFP和HSA的整體結構和脂肪酸結合袋比較

圖5.AFP和HSA的整體結構和脂肪酸結合袋比較

注：a.AFP（8X1N，洋紅色）和HSA（1E7H，黃綠色）的結構比較。?黃綠色箭頭表示HSA相對于A(yíng)FP偏移的方向。紅色虛線(xiàn)圈表示HSA比AFP多出二硫鍵。藍色虛線(xiàn)圈表示AFP和HSA之間不對應的二硫鍵。b. AFP-FA（粉色）和HSA-FA（綠色）的結構。脂肪酸是棕櫚酸（C16:0），在A(yíng)FP和HSA中分別以洋紅色和深綠色表示。不同的FA結合位點(diǎn)用阿拉伯數字表示。c. AFP（8X1N，洋紅色）和HSA（1E7H，黃綠色）子域的結構比較。FA在A(yíng)FP中分別為紫色，在HSA中為深綠色。圖中標出了與FA相關(guān)的氨基酸殘基。

2.5 小結

AFP和HSA是白蛋白家族的成員，表現出明顯的序列同源性。對它們的整體結構和各個(gè)領(lǐng)域的比較分析揭示了驚人的相似之處，表明了潛在的功能相似性。AFP和HSA在血液中起天然運輸載體的作用，可逆地與各種內源性和外源性分子結合，以運輸到不同的組織。AFP和HSA之間的一個(gè)顯著(zhù)相似之處是它們對FA的高親和力。AFP中FA結合口袋的結構特征在鑒定合適的FA治療分子中起著(zhù)至關(guān)重要的作用。例如，AFP結合口袋的大小決定了最佳FA鏈長(cháng)度，以獲得更高的親和力和更長(cháng)的體內半衰期。此外，口袋入口周?chē)被釟埢臉O性和電荷會(huì )影響FA結合。因此，摻入適當的修飾基團可以增強AFP和FA之間的親和力。然而，AFP和HSA并不相同，HSA比AFP具有更多的結合位點(diǎn)，這可能使其能夠與更多的生物分子相互作用。這可能是HSA成為成年人血液中最豐富的運輸載體的原因之一。

參考文獻

Liu K, Wu C, Zhu M, et al. Structural characteristics of alpha-fetoprotein, including N-glycosylation, metal ion and fatty acid binding sites[J]. Commun Biol, 2024,7(1):505.