糖類(lèi)抗原72-4（CA72-4）檢測的鼻祖級抗體CC49 & B72.3單抗的發(fā)現及反應性
糖類(lèi)抗原72-4（Carbohydrate antigen 72-4，CA72-4）又稱(chēng)腫瘤相關(guān)糖蛋白（TAG）-72，是一種與腫瘤相關(guān)的多形性上皮粘蛋白，分子量在220~400kDa之間。在胃癌、結腸癌、乳腺癌和肺癌等人類(lèi)腺癌中高表達，而在正常組織中表達量很低。PubMed數據庫中，文獻報道最多的TAG-72單克隆抗體（mAb）就是B72.3和第二代B72.3 mAb—CC49 mAb，B72.3和CC49 mAb所識別的表位分別是TAG-72上唾液酸Tn（Sialyl Tn，sTn，CD175s）和唾液酸T（Sialyl T，sT，CD176s）。B72.3 mAb是利用人類(lèi)轉移性乳腺腫瘤細胞的提取物作為免疫原通過(guò)小鼠雜交瘤技術(shù)獲得的單抗，CC49是第二代B72.3 mAb，免疫原采用的是LS-174T人結腸癌異種移植物純化獲得的TAG-72。CC49對TAG-72抗原的親和力優(yōu)于B72.3。CC49和B72.3 mAb識別TAG-72的表位不同，可以形成雙抗夾心用于癌癥患者血清CA72-4檢測。
B72.3抗體的發(fā)現
B72.3 mAb是1981年Colcher D等在篩選與乳腺腫瘤細胞系反應的單克隆抗體時(shí)發(fā)現的。B72.3 mAb是采用人肝臟轉移性乳腺腫瘤細胞膜富集提取物作為免疫原，通過(guò)小鼠雜交瘤技術(shù)獲得的IgG1型單克隆抗體。
1、抗原制備及免疫
Colcher D等用2名肝臟轉移性乳腺腫瘤患者的肝臟制備細胞膜富集提取物（稱(chēng)為Met1和Met2），以正常肝臟作為對照。為去除干擾固相放射免疫分析（RIA）的細胞相關(guān)免疫球蛋白，部分細胞提取物過(guò)葡萄球菌蛋白A-Sepharose（Pharmacia）柱。
4周齡的C57BL/ 6、BALB/c和C3HfC57BL小鼠通過(guò)腹腔接種100μg轉移性乳腺腫瘤細胞膜富集提取物與等體積的完全弗氏佐劑混合。14天和28天后，小鼠腹腔內接種100μg的免疫原和不完全弗氏佐劑。另外14天后，靜脈注射10μg免疫原。3-4天后取脾臟與NS-1非免疫球蛋白分泌小鼠骨髓瘤細胞融合，對雜交瘤進(jìn)行培養。通過(guò)固相放射免疫分析對雜交瘤分泌的免疫球蛋白進(jìn)行檢測，選取與受累肝臟轉移性乳腺腫瘤細胞提取物有反應，與正常人肝臟提取物不反應的細胞株。經(jīng)傳代培養，最終從4250份雜交瘤培養物中篩選出11株單克隆抗體。
2、B72.3單抗反應性
固相放射免疫分析及活細胞RIA檢測顯示，僅1株IgG1型mAb—B72.3與轉移性乳腺癌細胞膜富集提取物有反應，與正常肝臟細胞提取物、肉瘤和正常組織細胞系表面抗原均不反應。Colcher D等實(shí)驗使用的人乳腺癌細胞系為T(mén)-20、MCF-7和ZR-75-1，肉瘤細胞系為橫紋肌肉瘤（A204）、纖維肉瘤（HT1080）和黑色素瘤（A375）。正常組織細胞系來(lái)源于乳房（Hs0584Bst）、皮膚（Detroit 550）、胚胎皮膚（Detroit 551）、胎兒肺（WI -38和MRC-5）、胎兒睪丸（HsO181Tes）、胎兒胸腺（Hs0208）、胎兒骨髓（Hs074Bm）、胚胎腎臟（Flow 4000）、胎兒脾臟（Hs0203Sp）和子宮（Hs0769Ut）。
B72.3 mAb已證明對大多數人類(lèi)腺癌活檢有反應性，包括結直腸癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、乳腺癌和非小細胞肺癌，對正常成人組織包括（絕經(jīng)后婦女）增殖性和靜息性子宮內膜無(wú)反應或反應微弱。而研究顯示，B72.3反應抗原在分泌期子宮內膜中表達，在某些人類(lèi)胎兒組織（包括胎兒腸）中高表達。
表1. 單克隆抗體在固相RIA中的反應性
注：W6/32和B139為對照單克隆抗體，W6/32為抗人類(lèi)組織相容性抗原抗體，B139是針對人類(lèi)乳腺腫瘤轉移產(chǎn)生的抗體，但與所有測試的人正常組織細胞反應。
CC49抗體的發(fā)現
CC49是與腫瘤相關(guān)糖蛋白72（TAG-72）抗原反應的第二代B72.3單克隆抗體。B72.3單抗識別的抗原為T(mén)AG-72，由于缺乏可復制的TAG-72抗原來(lái)源及合適的細胞系進(jìn)行表達，TAG-72抗原的表達和純化一度受到阻礙。后來(lái)發(fā)現，分化良好的LS-174T細胞系是少數可與B72.3單抗弱結合的細胞系，當LS-174T細胞作為異種移植在無(wú)胸腺小鼠中生長(cháng)時(shí)，B72.3單抗結合增加了大約100倍，與許多人類(lèi)癌癥活檢的結合相當。Muraro R等人利用LS-174T細胞系產(chǎn)生的人結腸癌（CC）異種移植物提取TAG-72抗原，經(jīng)過(guò)幾種色譜程序純化后（包括B72.3 mAb親和純化），以TAG-72作為免疫原，通過(guò)小鼠雜交瘤技術(shù)獲得了IgG1型抗體—CC49單抗。
1、TAG-72抗原的制備純化
將大約3g冷凍的LS-174L結腸癌異種移植物在20mM Tris-HCl（pH7.2）+150mM NaCl（TBS）中混勻后，用玻璃棉過(guò)濾。使用預先在TBS中平衡的Sepharose CL-4B柱-施膠柱進(jìn)行親和純化（5.5x25cm，Pharmacia，Uppsala，Sweden），用TBS洗脫，收集餾分。在固相RIA中進(jìn)行測試，收集TAG-72峰值組分，加載到TBS平衡的B72.3親和色譜柱[100ml Reactor-Gel MW65F（Pierce，Rockford，IL）與200mg B72.3 IgG耦合]。用TBS洗滌，結合蛋白用3.0M Nal在TBS中洗脫。洗脫液在固相RIA中進(jìn)行測試，收集TAG-72組分，在20mM Tris-HCI（pH 7.2）中進(jìn)行透析，使用Aquacide II（Calbiochem，San Diego，CA）進(jìn)行濃縮，在TBS中進(jìn)行透析，純化的TAG-72保存在-70℃。
2、TAG-72免疫
10μg上述純化的TAG-72與等體積的完全弗氏佐劑預混合后，對3只4周齡BALB/c小鼠進(jìn)行接種免疫。80天后，小鼠接受50μg純化的TAG-72增強劑（預混合等量的不完全弗氏佐劑）。7天后，小鼠靜脈注射純化的TAG-72鹽水。3天后取脾細胞，與NS-1小鼠骨髓瘤細胞（ATCC No. TIB-18）進(jìn)行融合，制備雜交瘤細胞。利用固相RIA篩選與乳腺癌、結腸癌活檢提取液反應，與正常肝臟、脾臟活檢富膜提取物不反應的雜交瘤細胞。
3、CC49單抗反應性
固相RIA活檢反應結果顯示，CC49單抗對LS-174T結腸癌細胞系提取物和乳腺癌提取物的反應一樣強烈。免疫組織化學(xué)分析試驗顯示，CC49 mAb與B72.3 mAb相同，與正常成人分泌性子宮內膜組織反應，與絕經(jīng)后婦女的增殖子宮內膜和靜息子宮內膜組織不反應?；罴毎Y合試驗顯示，CC49 mAb與培養的LS-174T活細胞表面抗原反應比B72.3強烈。
表2. CC49與B72.3單抗的反應性差異
| 檢測項目 | CC49 mAb | B72.3 mAb | |
|---|---|---|---|
| 固相RIA活檢 | LS-174T結腸癌 細胞系提取物 |
強 | 弱 |
| 乳腺癌提取物 | 強 | 與其中3種缺乏反應 | |
| 正常胃組織 | 強 | 弱 | |
| 采用固相免疫法測定 親和力（Ka） |
TAG-72抗原 | 親和力高于B72.3 Ka為16.18×109M-1 |
親和力低于CC49 Ka為2.54×109M-1 |
| 活細胞結合實(shí)驗 | LS-174T活細胞 表面抗原 |
強 | 弱 |
| 流式細胞術(shù)分析 | 胸腔滲出人乳腺癌 細胞表面抗原 |
強 | 弱 |
| 免疫組織化學(xué)分析 | 分泌性子宮內膜組織 （正常成人） |
反應 | 反應 |
| 增殖子宮內膜組織 （絕經(jīng)后婦女） |
缺乏反應 | 缺乏反應 | |
| 靜息子宮內膜組織 （絕經(jīng)后婦女） |
缺乏反應 | 缺乏反應 | |
圖1. B72.3、CC49 mAb與人胸腔積液乳腺癌細胞表面結合的流式細胞分析
注：＿為陰性對照抗體MOPC-21；﹍為B72.3單抗；﹎為CC49單抗。
表3. CC單克隆抗體在固相RIA與TAG-72和癌活檢中的反應性
表4. CC單抗在固相RIA與正常組織活檢中的反應性
表5. CC單克隆抗體與細胞表面抗原的反應性
CC49和B72.3單抗用于CA72-4檢測
以“CA72-4”和“Carbohydrate antigen 72-4”為關(guān)鍵詞在PubMed數據庫進(jìn)行檢索，檢索到最早的文章是1988年Ohuchi N等發(fā)表的關(guān)于CA72-4 RIA檢測試劑盒的文章。Ohuchi N等利用可以識別TAG-72的CC49和B72.3單抗制成CA72-4 RIA試劑盒，用于測量癌癥患者循環(huán)腫瘤相關(guān)糖蛋白（TAG-72）的水平。Ohuchi N的團隊通過(guò)468個(gè)健康個(gè)體CA72-4的水平和分布得到臨界值4.0U/mL。82例胃癌、55例結直腸癌、24例胰膽總管癌、36例乳腺癌、3例卵巢癌的陽(yáng)性率分別為52%、55%、46%、39%、67%。來(lái)自205名癌癥患者的血清中有50%的CA72-4水平升高，而92名沒(méi)有惡性腫瘤患者的血清中只有10%的水平超過(guò)4.0U/mL。惡性腫瘤患者血清CA72-4平均水平為38.6U/mL，遠高于非惡性腫瘤患者（2.7U/mL）。胃腸道癌癥晚期或復發(fā)患者血清CA72-4水平高于早期癌癥患者。Ohuchi N等證實(shí)了CA72-4可作為臨床新型腫瘤標志物，用于監測胃腸道癌、乳腺癌、卵巢癌和其他上皮惡性腫瘤患者的血清TAG-72水平。
參考文獻
[1] Colcher D, Hand PH, Nuti M, et al. A spectrum of monoclonal antibodies reactive with human mammary tumor cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1981, 78 (5): 3199-203.
[2] Muraro R, Kuroki M, Wunderlich D, et al. Generation and characterization of B72.3 second generation monoclonal antibodies reactive with the tumor-associated glycoprotein 72 antigen[J]. Cancer Res, 1988, 48 (16): 4588-96.
[3] Ohuchi N, Takahashi K, Matoba N, et al. A radioimmunometric assay for circulating tumor-associated glycoprotein (TAG-72) using the antigen determinant CA 72-4[J]. Gan To Kagaku Ryoho, 1988, 15 (9): 2761-6.
[4] Ohuchi N, Matoba N, Taira Y, et al. Levels of circulating tumor-associated glycoprotein (TAG-72) in patients with carcinoma using a novel tumor marker, CA 72-4[J]. Gan To Kagaku Ryoho, 1988, 15 (9): 2767-72.
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