膠體金實(shí)驗影響因素
對于產(chǎn)業(yè)化應用的抗原、抗體診斷原料，大多都可以滿(mǎn)足膠體金檢測平臺的要求，但是由于體外診斷（IVD）試劑原料產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，很多IVD原料供應商不會(huì )對自己的抗原/抗體診斷原料是否可以應用于膠體金平臺而進(jìn)行驗證。相對來(lái)說(shuō)，膠體金方法對抗原、抗體診斷原料的要求是比較高的，因為不管是膠體金標記還是NC膜包被都是基于物理吸附作用，這種結合過(guò)程是相對脆弱的，很容易受到干擾。本文主要對與抗原/抗體有關(guān)的膠體金實(shí)驗影響因素做一介紹。
1. 蛋白純化方法
鎳柱純化：重組抗原/抗體通常帶有his等標簽，通過(guò)鎳柱純化得到的抗原/抗體診斷原料含有大量的咪唑。微量的咪唑足可以使膠體金聚集、死金、沉淀，而且以包涵體形式表達的蛋白，往往需要高濃度的尿素來(lái)溶解，尿素對膠體金的破壞也是非常嚴重的。
硫酸銨沉淀或DEAE純化：硫酸銨沉淀或DEAE純化的血清含有大量的可競爭性結合膠體金顆粒表面結合位點(diǎn)的雜蛋白，產(chǎn)生的強電解質(zhì)和高鹽成分，從而影響檢測分析的結果并降低檢測分析的靈敏度。
ProteinA/G純化：如果采用A蛋白或G蛋白柱層析純化小鼠腹腔血清抗體作為膠體金結合物標記原料，由于抗體原料中含有大量的非特異性的小鼠本身IgG，導致膠體金結合物中含有大量非特異性的膠體金結合物，從而降低檢測分析的靈敏度。而重組抗體則會(huì )避免小鼠自身的IgG，且純度較高。
解決方法：如果抗原、抗體存在上述干擾物質(zhì)，建議可以通過(guò)超濾或者透析去除。很多人反饋在透析重組抗原/抗體診斷原料的時(shí)候，很容易產(chǎn)生大量的沉淀，特別是包涵體抗原。主要原因是透析液不太合適，應選擇盡量偏離蛋白等電點(diǎn)的pH緩沖液，如果不確定蛋白的等電點(diǎn)，建議用20mM Tris-HCL(8.5)或者20mM Tris-甘氨酸(8.5)來(lái)做透析液，適用于絕大部分的抗原抗體原料。
2. 抗體亞型
單克隆抗體需要特別注意的是，不同的單抗類(lèi)和亞型對膠體金標記的影響。一般來(lái)講，IgG1亞型標記效果最好，其它亞型和類(lèi)或多或少存在一定的局限性，但是我們經(jīng)常會(huì )篩選到IgG2a、IgG2b這些亞型，甚至偶爾會(huì )遇到IgM、IgA，此時(shí)，這些最好用于NC膜的包被，絕大部分的亞型和類(lèi)包被NC膜都沒(méi)有問(wèn)題。如果確實(shí)需要用于膠體金標記，建議有條件使用（如高標記pH，低標記量，強封閉）。
3. 蛋白純度
在體外診斷試劑制備過(guò)程中，抗體標記效率與抗體的純度有關(guān)。當抗體純度較低時(shí)，會(huì )導致抗體與其他雜蛋白被一起標記，從而影響了體外診斷試劑的反應性能，如特異性、反應信號、背景值等?？贵w的純度通常由細胞培養工藝和抗體純化工藝所決定。使用無(wú)血清培養基可以很大程度上去除血清培養基中帶來(lái)的雜質(zhì)蛋白，而蛋白質(zhì)純化工藝則可以進(jìn)一步將抗體中絕大多數雜質(zhì)去除。
4. 保存液
在蛋白的保存過(guò)程中，可能會(huì )加入一些甘油、蔗糖之類(lèi)的物質(zhì)作為保護劑，而這些保護劑由于其強親水性，對抗原/抗體診斷原料的膠體金標記和包被都會(huì )產(chǎn)生不利影響。
比較理想的抗原、抗體保存液：10mM/20mM PB（7.4~8.0）、10mM/20mM PBS（7.4~8.0）、20mM Tris-HCL（8.0~9.0）、20mM Tris-甘氨酸（8.0~9.0）。另外，可加入適量防腐劑，如：0.1%~0.5%疊氮鈉，不推薦使用ProClin300防腐，ProClin300對膠體金標記會(huì )有一定程度的影響，雖然這種影響并不是很?chē)乐?，但是有潛在的風(fēng)險。
膠體金檢測常見(jiàn)問(wèn)題分析
（1）在膠體金檢測平臺，C、T線(xiàn)顏色不一致，檢測結果如何判斷？
若是消線(xiàn)法，只要C，T線(xiàn)在規定時(shí)間內都顯色，不管顏色是否一致，就可判為陰性，T線(xiàn)不顯色則判為陽(yáng)性。
若是比色法，T線(xiàn)比C線(xiàn)深，判為陰性，T線(xiàn)比C線(xiàn)淺或T線(xiàn)不顯色，則判為陽(yáng)性。
對于夾心法產(chǎn)品，只要C，T線(xiàn)在規定時(shí)間內都顯色，就可判為陽(yáng)性，T線(xiàn)顯色越深，表示陽(yáng)性越強。
（2）在使用膠體金檢測卡過(guò)程中，能否用水或者其他液體作為陰性樣本對照？
不能。一方面因為檢測樣本成分很復雜，用水作為陰性對照沒(méi)有參考意義。另一方面不同的產(chǎn)品檢測體系不同，用水作對照容易造成假陽(yáng)或漏檢等現象。
（3）不同廠(chǎng)家的膠體金檢測卡作比較時(shí)，能做幾份標本就下結論判斷哪家產(chǎn)品好嗎？
不能。判斷膠體金試紙條主要的指標有試劑的靈敏度、特異性、穩定性、精密度等指標，其中靈敏度和特異性是最關(guān)鍵的。靈敏度的考評就需要由不同樣本做添加，還需要由高濃度的陽(yáng)性樣本做倍比稀釋。特異性也需要做不同區域和特殊樣本的檢驗。因為不同廠(chǎng)家的檢測條雖然原理是相同的，但原料來(lái)源不相同，做幾份是不能反映檢測條的綜合性能指標。
（4）樣品層析速度慢或者不發(fā)生層析
原因分析：
加樣量太少
樣本過(guò)于粘稠
試紙條失效
建議處理方案
增加加液量或滴加少量輔助液
滴加少量輔助液，對樣本進(jìn)行預處理以去除沉淀物
更換新試紙條重新檢測，試紙條現拆現用
（5）測全血時(shí)，有大量的全血樣本析出，NC膜背景偏紅，影響結果判讀
原因分析：
該試紙條NC膜嚴重受損或斷裂
使用已溶血的全血標本
建議處理方案
更換新試紙條重新檢測
盡量使用新鮮全血檢測
（6）漏檢率偏高
原因分析：
檢測時(shí)間太短，判斷結果過(guò)早
加樣量太少，輔助液滴加過(guò)量，樣本被稀釋
樣本中被檢物濃度太低
個(gè)別樣本中含有較為特殊物質(zhì)，樣本的pH值過(guò)高或過(guò)低
該試紙條受潮，活性下降或失活
建議處理方案
按說(shuō)明書(shū)要求正確判讀，建議對于較弱性或陰性樣本可延遲
按說(shuō)明書(shū)要求正確加樣或輔助液
采用其他檢測方法進(jìn)行確認
（7）檢測結果假陽(yáng)性率高
原因分析：
該試紙條靈敏度偏高
該樣本含有特殊干擾物或已被污染
在規定時(shí)間后判讀結果
建議處理方案
提前判讀結果或更換新檢測卡重新檢測
用其他檢測方法確診檢測結果，確保樣本不受污染
按說(shuō)明書(shū)要求正確判讀結果，超出判讀結果的時(shí)間范圍，結果不準確
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