WS/T 677-2020人群維生素D缺乏篩查方法

中華人民共和國國家衛生健康委員會(huì )發(fā)布
2020-05-06 發(fā)布，2020-11-01實(shí)施

本標準按照GB/T 1.1—2009給出的規則起草。

本標準起草單位：中國疾病預防控制中心營(yíng)養與健康所、寧波市疾病預防控制中心、深圳市慢性病防治中心、深圳市計量質(zhì)量檢測研究院、南京醫科大學(xué)、中糧營(yíng)養健康研究院。

本標準主要起草人：楊麗琛、楊曉光、胡貽椿、金米聰、楊國武、周繼昌、汪之頊、賈健斌、王俊、陳曉紅、張協(xié)光、莫俊鑾、毛德倩、付志成、王睿、丁葉、周明、陳競、張森。

1 范圍

本標準規定了人群維生素D缺乏和不足篩查的指標、參考判定值和檢測方法。

本標準適用于人群維生素D營(yíng)養狀況的判定。

2 規范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
GB/T 603 化學(xué)試劑 試驗方法中所用制劑及制品的制備
GB/T 6682 分析實(shí)驗室用水規格和試驗方法
WS/T 225 臨床化學(xué)檢驗血液標本的收集與處理

3 術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1 25-羥基維生素D 25-hydroxyvitamin D；25(OH)D

血液中維生素D的主要循環(huán)形式，穩定性好，是公認的評價(jià)人體維生素D營(yíng)養狀況的可靠指標，主要包括兩種形式：25(OH)D₂、25(OH)D₃，其中25(OH)D₃是血液中維生素D的主要存在形式。

3.2 維生素D缺乏 vitamin D deficiency

當人體血清（或血漿）25-羥基維生素D含量低于缺乏的參考判定值時(shí)，可判定為維生素D缺乏。

3.3 維生素 D不足 vitamin D insufficiency

當人體血清（或血漿）25-羥基維生素D含量低于正常人群的參考判定值，但高于缺乏參考判定值時(shí)，可判定為維生素D不足。

4 人群維生素D營(yíng)養狀況判定指標及參考判定值

人群維生素D營(yíng)養狀況判定指標及參考判定值見(jiàn)表1。

5 測定方法

5.1 血液標本的采集與保存

按附錄A規定的方法進(jìn)行。

5.2 第一法：液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

按附錄B規定的方法進(jìn)行。

5.3 第二法：化學(xué)發(fā)光免疫法

按附錄C規定的方法進(jìn)行。

5.4 第三法：酶聯(lián)免疫法

按附錄D規定的方法進(jìn)行。

附錄A

血液標本的采集與保存

A.1 標本采集

A.1.1 血液標本的采集

空腹靜脈血，取血方法依據WS/T 225 以及檢測方法的要求采集空腹靜脈血1mL。

A.1.2 采血管

根據所需血清或血漿，使用不同采血管分裝。

A.2 血清、血漿保

標本于2℃～8℃可穩定7d，-20℃可穩定12個(gè)月。若標本不能及時(shí)檢測，建議適量分裝后于-70℃以下存放標本，僅一次凍融。

附錄B

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

B.1 原理

血清（血漿）中的25(OH)D2和25(OH)D3經(jīng)甲醇/乙腈沉淀蛋白，采用正己烷萃取，氮氣吹干，用初始流動(dòng)相復溶，使用液相色譜法分離，串聯(lián)質(zhì)譜多反應監測模式（MRM）檢測，同位素內標法定量，該方法可以分別測定25(OH)D₂和25(OH)D₃。

B.2 試劑和溶液

除非另有說(shuō)明，本方法所有試劑均為分析純，水符合GB/T 6682中一級用水規定，溶液按照GB/T 603配制。

B.2.1 試劑

B.2.1.1 25(OH)D?₂標準品（C₂₈H₄₄O₂，CAS：21343-40-8）：純度＞98%或有證標準物質(zhì)。

B.2.1.2 25(OH)D3標準品（C₂₇H_{44O2，CAS：19356-17-3）：純度＞98%或有證標準物質(zhì)。}

B.2.1.3 同位素內標[²H₃]-25(OH)D₂標準品（C₂₈H₄₁²H₃O₂，CAS：1217467-39-4）：純度＞98%。

B.2.1.4 同位素內標[²H₃]-25(OH)D₃標準品（C₂₇H₄₁²H₃O₂，CAS：140710-94-7）：純度＞98%。

B.2.1.5 甲醇（CH₃OH）：色譜純。

B.2.1.6 正己烷（C₆H₁₄）：色譜純。

B.2.1.7 甲酸（HCOOH）：色譜純。

B.2.1.8 牛血清白蛋白（BSA）：純度≥98%。

B.2.1.9 氮氣（N2）：純度≥99.9%。

B.2.1.10 甲酸-水溶液：0.1%。

B.2.1.11 甲酸-甲醇溶液：0.1%。

B.2.1.12 乙腈（CH₃CN）：色譜純。

B.2.1.13 BSA牛血清白蛋白水溶液：1%。

B.2.1.14 沉淀劑：甲醇+乙腈（1+1）。

B.2.1.15 標準儲備溶液（10μg/mL）：分別稱(chēng)取25(OH)D₂和25(OH)D₃標準品1mg（精確至0.01mg）于2個(gè)100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。此溶液中25(OH)D₂和25(OH)D₃ 的濃度為10μg/mL。溶液轉移至試劑瓶中后，-20℃下避光保存，備用。

B.2.1.16 同位素內標標準儲備溶液（10μg/mL）：分別稱(chēng)取同位素內標[²H₃]-25(OH)D₂和[²H₃]-25(OH)D₃ 1mg（精確至0.01mg），于2個(gè)100mL容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度。此溶液中[²H₃]-25(OH)D₂和[²H₃]-25(OH)D₃的濃度為10μg/mL。溶液轉移至試劑瓶中，-20℃下避光保存，備用。

B.2.1.17 標準系列溶液：分別準確移取25(OH)D₂（10μg/mL）和25(OH)D₃（10μg/mL）5μL、10μL、25μL、50μL、125μL、250μL和500μL于7個(gè)10mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度。此系列溶液的25(OH)D₂和25(OH)D₃的濃度為5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、125ng/mL、250ng/mL和500ng/mL。

B.2.1.18 混合同位素內標溶液（100ng/mL）：分別準確吸取同位素內標[²H₃]-25(OH)D₂儲備溶液（10μg/mL）和[²H₃]-25(OH)D₃儲備溶液（10μg/mL）各100μL，于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度。此溶液的同位素內標[²H₃]-25(OH)D₂和[²H₃]-25(OH)D₃的濃度均為100ng/mL。溶液轉移至試劑瓶中后，-20℃下避光保存，備用。

B.2.2 儀器和設備

B.2.2.1 分析天平，感量：0.0001g。

B.2.2.2 分析天平，感量：0.00001g。

B.2.2.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀。

B.2.2.4 氮吹儀或真空離心干燥儀。

B.2.2.5 離心機：離心力≥12000×g。

B.2.2.6 旋渦混合器。

B.2.2.7 移液槍或移液器。

B.3 分析步驟

B.3.1 樣品制備

取血清（血漿）樣品200μL至2mL離心管中，加入20μL混合同位素內標溶液，渦旋振蕩30s。加入400μL沉淀劑（甲醇+乙腈，1+1），室溫下渦旋振蕩混勻30s；加入1.2mL正己烷，室溫下渦旋振蕩5min，然后在4℃和離心力大于12000×g下離心5min；吸取1.0mL上清液至1.5mL離心管中，室溫下用氮氣吹至干；用100μL初始流動(dòng)相復溶，渦旋振蕩30s，4℃和離心力大于12000×g下離心5min，上清液轉移至進(jìn)樣瓶中待LC-MS/MS分析。

B.3.2 標準工作溶液制備

取7個(gè)2mL離心管，分別加入180μL空白替代血清樣品（1%BSA牛血清白蛋白水溶液），以及20μL標準系列溶液（B.2.1）和20μL混合同位素內標溶液，此系列相當于0.5ng/mL～50ng/mL濃度范圍。旋渦振蕩30s。以下操作同B.3.1。

B.3.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀參數設置

B.3.3.1 液相色譜分析參考條件：

a) 色譜柱：C₁₈柱（柱長(cháng)100mm，柱內徑2.1mm，填料粒徑1.7μm，或者具同等柱效的色譜柱)；
b) 流動(dòng)相：A相：含0.1%甲酸的水溶液；B相：含0.1%甲酸的甲醇溶液；
c) 梯度洗脫：見(jiàn)表B.1；
d) 流速：0.30mL/min；
e) 柱溫：40℃；
f) 進(jìn)樣體積：10μL。

B.3.3.2 質(zhì)譜測定參考條件：

a) 電離方式：電噴霧電離，正離子模式（ESI⁺ ）；
b) 檢測方式：多反應監測模式（MRM）；
c) 氣簾氣：0.25MPa；
d) 噴霧電壓：4000V；
e) 去溶劑氣溫度：450℃；
f) 霧化氣：0.35MPa；
g) 去溶劑氣：0.35MPa；
h) MRM離子對參數見(jiàn)表B.2所示。

B.3.4 定性測定

在同一色/質(zhì)譜條件下進(jìn)行標準溶液和樣品溶液的測定，如果樣品溶液中檢出的色譜峰的保留時(shí)間與標準溶液中檢出的色譜峰的保留時(shí)間一致，所選擇的離子對的質(zhì)荷比也一致，而且樣品溶液中定性離子對的相對豐度與濃度相當的標準溶液中的定性離子對的相對豐度比較，相對偏差也不超過(guò)表B.3規定的范圍，則可判定樣品溶液中存在該物質(zhì)。

B.3.5 工作曲線(xiàn)的制作

在B.3.3的液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜分析條件下，將B.3.2得到的標準工作溶液由低濃度到高濃度進(jìn)行進(jìn)樣分析，以25(OH)D₂和25(OH)D₃色譜峰，與其對應的同位素內標色譜峰的峰面積比值-濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到標準工作溶液的直線(xiàn)擬合方程，其線(xiàn)性相關(guān)系數應大于0.99。

B.3.6 樣品測定

在B.3.3的液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜分析參考條件下，將B.3.1得到的待測樣品溶液進(jìn)樣分析，按內標法計算待測試樣溶液中目標物的質(zhì)量濃度。待測試樣溶液中的目標物的質(zhì)量濃度應在標準工作曲線(xiàn)的線(xiàn)性范圍內，超過(guò)線(xiàn)性范圍則應適當稀釋樣品后再重復處理測定。

B.3.7 空白試驗

以1%BSA牛血清白蛋白水溶液代替血清（血漿）樣品，按B.3.1的步驟做空白試驗。

B.4 質(zhì)量控制

B.4.1 內部質(zhì)控

實(shí)驗室應制定測試結果質(zhì)量控制程序，明確內部質(zhì)量控制的內容、方式和要求。隨同樣品檢測需測定質(zhì)量控制樣品，繪制質(zhì)量控制圖，觀(guān)察測試工作的穩定性、系統偏差及趨勢，及時(shí)發(fā)現異?，F象并采取相應的改進(jìn)措施。

B.4.2 外部質(zhì)控

實(shí)驗室應參加國內外實(shí)驗室認可機構組織的能力驗證活動(dòng)，參加國際間、國內同行間的實(shí)驗室比對試驗。根據外部評審、能力驗證、考核、比對等結果評估檢驗結果的質(zhì)量并采取相應的改進(jìn)措施。

B.5 分析結果的計算

血清（血漿）樣品中25(OH)D2和25(OH)D3 的質(zhì)量濃度按式（B.1）計算：

C_target=c......................................(B.1)

式中：
C_target——血清（血漿）樣品中目標物的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；
c——工作曲線(xiàn)中查出的樣品濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；

注：結果用平行測定的算術(shù)平均值表示，保留小數點(diǎn)后一位，血漿(血清)中25(OH)D總含量為25(OH)D₂和25(OH)D₃含量相加。

B.6 精密度

在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。

B.7 檢出限和定量限

本方法25(OH)D₂、25(OH)D₃檢出限均為0.15ng/mL，定量限均為0.5ng/mL。

B.8 回收率

本方法的添加回收率為84.0%～106.0%。

B.9 25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3標準溶液LC-MS/MS色譜圖

25(OH)D₂和25(OH)D₃標準溶液的LC-MS/MS色譜圖見(jiàn)圖B.1，[²H₃]-25(OH)D₂和[²H₃]-25(OH)D₃標準溶液的LC-MS/MS色譜圖見(jiàn)圖B.2。

說(shuō)明：圖B.1和圖B.2中峰1為[²H₃]-25(OH)D_3>；峰2為[²H₃]-25(OH)D₂。

詳細內容見(jiàn)PDF