化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（CLEIA）發(fā)光原理
化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（Chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是將高靈敏度的化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)與高特異性的酶免疫分析技術(shù)相結合，用于檢測微量物質(zhì)的免疫檢測技術(shù)。CLEIA反應基本原理是用參與催化某一發(fā)光反應的酶來(lái)標記抗體（或抗原），在抗原-抗體反應后加入化學(xué)發(fā)光底物，酶催化和分解底物發(fā)光，用光檢測儀檢測發(fā)光強度，最后通過(guò)標準曲線(xiàn)，根據光強換算出被測物的濃度。CLEIA常用方法包括：用于大分子抗原檢測的雙抗體夾心法、用于抗體檢測的雙抗原夾心法，和用于多肽類(lèi)小分子抗原測定的競爭法。根據標記酶和酶促化學(xué)發(fā)光底物的不同CLEIA又可以分成不同的反應體系，其中辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（ALP）作為標記酶的CLEIA反應體系是最為常見(jiàn)的。
ALP標記的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析
堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）是一種分子量為80kD或100kD的磷酸單酯水解酶，可從大腸桿菌或小牛腸黏膜提取獲得。ALP最適pH為9.6（腸黏膜）或8.0（菌源性），在堿性環(huán)境中能夠將底物去磷酸化。堿性磷酸酶的酶促化學(xué)發(fā)光底物有AMPPD（1，2－二氧環(huán)乙烷衍生物，螺旋金剛烷）、CDP Star、APS-5等，其中AMPPD是最常見(jiàn)的ALP酶促化學(xué)發(fā)光底物。
1）ALP-AMPPD發(fā)光體系
AMPPD中文全稱(chēng)為3-（2-螺旋金剛烷）-4-甲氧基-4-（3-磷氧酰）-苯基-1，2-二氧環(huán)乙烷，是一種生物化學(xué)領(lǐng)域中超靈敏的堿性磷酸酶底物，具有底物穩定性好、反應速度快的特點(diǎn)。AMPPD分子結構中有兩個(gè)重要部分，一個(gè)是連接苯環(huán)和金剛烷的二氧四節環(huán)，它可以斷裂并發(fā)射光子；另一個(gè)是磷酸根基團，它維持著(zhù)整個(gè)分子結構的穩定。堿性條件下AMPPD在A(yíng)LP的作用下脫去磷酸根基團，形成一個(gè)不穩定的中間體AMPD。AMPD分子內電子轉移后裂解成金剛烷酮和處于激發(fā)態(tài)的間氧苯甲酸甲酯陰離子，釋放出光子回到基態(tài)，產(chǎn)生470nm的光，持續時(shí)間可達幾十分鐘至數小時(shí)。
2）ALP-CDP Star發(fā)光體系
CDP-Star中文名為2-氯-5-（4-甲氧基螺[1，2-二氧雜環(huán)丁烷-3，2′-（5-氯三環(huán)[3.3.1.13.7]癸烷]）-4-基] -1-苯基磷酸二鈉，是由AMPPD改進(jìn)而來(lái)，對ALP標記分子的檢測更靈敏，反應動(dòng)力學(xué)更好。CDP-Star具有低背景、酶催化強度高、光輸出時(shí)間長(cháng)的特點(diǎn)。
3）ALP-APS-5發(fā)光體系
APS-5中文名為9-（4'-氯苯硫代磷酰氧亞甲基）-10-甲基-9，10-二氫化吖啶二鈉鹽，是一種基于9，10-二氫吖啶的發(fā)光底物，在A(yíng)LP作用下可以持續發(fā)光。APS-5對ALP標記分子的檢測靈敏，但未在A(yíng)LP標記的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析上廣泛應用。
HRP標記的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析
辣根過(guò)氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）來(lái)源于蔬菜植物辣根中，分子量為40kD，由無(wú)色的糖蛋白（主酶）和亞鐵血紅素（輔基）結合而成。輔基是酶活性基團，最大吸收峰在403nm處；而主酶與酶活性無(wú)關(guān)，最大吸收峰在275nm。HRP常用的化學(xué)發(fā)光底物為魯米諾（3-氨基苯二甲酰肼）、異魯米諾（4-氨基苯二甲酰肼）及其衍生物。用于辣根過(guò)氧化物酶（HRP）的化學(xué)發(fā)光底物多為雙組分系統，穩定的H2O2和魯米諾（5－氨基－鄰苯二甲酰肼）是經(jīng)典的HRP標記CLEIA反應體系。
1）HRP-H2O2-魯米諾發(fā)光體系
魯米諾（Luminol）又名發(fā)光氨，是一種化學(xué)熒光分子。堿性條件下，HRP催化魯米諾和過(guò)氧化氫的氧化反應，魯米諾與氫氧化物反應時(shí)生成了一個(gè)雙負離子（Dianion），它可被過(guò)氧化氫分解出的氧氣氧化，產(chǎn)物為一個(gè)有機過(guò)氧化物。該過(guò)氧化物立即分解出氮氣（魯米諾被有機氧化劑如二甲基亞砜氧化后不是生成氮氣，而是生成含氮有機物），生成激發(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸。激發(fā)態(tài)至基態(tài)轉化中，釋放的能量以光子的形式存在，波長(cháng)位于可見(jiàn)光的藍光部分，可在425nm下進(jìn)行檢測。
2）HRP-H2O2-魯米諾-增強劑發(fā)光體系
傳統的HRP-H2O2-魯米諾CLEIA反應體系發(fā)光量低、不易測量，在發(fā)光體系中加入增強劑，魯米諾的發(fā)光靈敏度和發(fā)光信號提高，同時(shí)發(fā)光穩定時(shí)間延長(cháng)，降低氧化劑與發(fā)光劑等單獨作用時(shí)出現的“本底”發(fā)光。常用的增強劑有苯酚類(lèi)、芳香胺類(lèi)及苯基硼酸衍生物等，其中苯基硼酸類(lèi)增強劑可以和苯酚類(lèi)增強劑同時(shí)加入以提高分析靈敏度。
增強劑增強原理
當等量的H2O2與HRP混合后，有活性的酶底物復合物（Complex Ⅰ）迅速形成，但Complex Ⅰ與供氫體結合形成的復合物（Complex Ⅱ）形成速度較慢，而酚類(lèi)及其芳香胺類(lèi)等化合物都可作為HRP的第二底物（即供氫體），使得在反應中Complex Ⅰ及Complex Ⅱ的靜態(tài)濃度增大，顯著(zhù)加快酶的循環(huán)速度。在增強劑的作用下，HRP-H2O2-魯米諾體系中的信號都被不同程度的增強，一定程度上解決了發(fā)光體系量子效率低、反應發(fā)光時(shí)效短等缺點(diǎn)，使HRP的靈敏度及精密度大大提高。
參考文獻
[1] 李金明, 劉輝, 邵啟祥, 等. 臨床免疫學(xué)檢驗技術(shù)[M]. 北京: 人民衛生出版社, 2015, 42-45.
[2] 高榮. β-hCG化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法的建立[D]. 吉林大學(xué), 2007.
[3] 魏光偉, 余永鵬, 魏文康,等. 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)及其應用研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫學(xué)進(jìn)展, 2010, 31(3): 6.
[4] 張靜. 恩諾沙星化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法研究[D]. 鄭州大學(xué), 2010.
[5] 沙栩正, 鄒應全. 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析研究進(jìn)展[J]. 理化檢驗:化學(xué)分冊, 2010.
[6] 司夢(mèng)軍. 增強化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析新體系的研究及應用[D]. 青島科技大學(xué).
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