化學(xué)發(fā)光免疫分析平臺
發(fā)光是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態(tài)（較低能級）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級），然后在返回到基態(tài)并釋放光子的過(guò)程。根據形成激發(fā)態(tài)分子的能量來(lái)源不同發(fā)光可以分為光照發(fā)光、生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光。
化學(xué)發(fā)光（chemiluminescence，CL）是指伴隨化學(xué)反應過(guò)程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現象。反應體系中的某些物質(zhì)分子，如反應物、中間體或者熒光物質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)反應時(shí)，由于吸收了反應時(shí)產(chǎn)生的化學(xué)能，使反應產(chǎn)物分子激發(fā)至激發(fā)態(tài)，受激分子由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)，便發(fā)出一定波長(cháng)的光?；瘜W(xué)發(fā)光分析方法主要是依據化學(xué)發(fā)光檢測體系中待測物濃度與體系的化學(xué)發(fā)光強度在一定條件下呈線(xiàn)性定量關(guān)系的原理，利用儀器對體系化學(xué)發(fā)光強度進(jìn)行檢測，而確定待測物含量的一種痕量分析方法。
1977年，Halman等將化學(xué)發(fā)光與抗原抗體免疫反應相結合，創(chuàng )建了化學(xué)發(fā)光免疫分析方法（chemiluminescent immunoassay，CLIA），相較于傳統免疫技術(shù)（放射免疫技術(shù)、酶免疫技術(shù)、熒光免疫技術(shù)等），CLIA具有自動(dòng)化程度高、特異性好、精確度高、檢測范圍廣等優(yōu)勢。
化學(xué)發(fā)光免疫分析方法類(lèi)型及其原理
CLIA包含兩個(gè)部分，即化學(xué)發(fā)光分析系統和免疫反應系統?；瘜W(xué)發(fā)光分析系統是利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化，形成一個(gè)激發(fā)態(tài)的中間體，當這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩定的基態(tài)時(shí)，同時(shí)發(fā)射出光子(hν)利用發(fā)光信號測量?jì)x器測量光量子產(chǎn)額。免疫反應系統是將發(fā)光物質(zhì)(在反應劑激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體)直接標記在抗原或抗體上，或酶作用于發(fā)光底物?；瘜W(xué)檢測系統通過(guò)光電信號檢測儀檢測發(fā)光強度，最后通過(guò)化學(xué)發(fā)光標記物與發(fā)光強度的關(guān)系確定被測物的含量。
CLIA根據標記物的不同可分為三大類(lèi)，即直接化學(xué)發(fā)光免疫分析、酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析和電化學(xué)發(fā)光免疫分析。
直接化學(xué)發(fā)光
化學(xué)發(fā)光劑直接標記抗體或抗原的免疫測定方法稱(chēng)為化學(xué)發(fā)光免疫分析。直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過(guò)程中不需要酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應，他們在化學(xué)結構上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團，可直接標記抗原或抗體，目前常見(jiàn)的直接化學(xué)發(fā)光標記物主要有吖啶酯類(lèi)化學(xué)發(fā)光劑。
用吖啶酯直接標記抗體，與待測標本中相應的抗原發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體-待測抗原-吖啶酯標記抗體復合物，這時(shí)只需加入氧化劑（H202）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯即可在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光。由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時(shí)間內所產(chǎn)生的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，可從標準曲線(xiàn)上計算出待測抗原的含量。
直接化學(xué)發(fā)光速度快、試劑穩定性好，但靈敏度略低于酶促發(fā)光。
酶促化學(xué)發(fā)光
酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescentenzymeimmunoassay，CLELA)是以酶標記抗原或抗體進(jìn)行免疫反應，免疫反應復合物上的酶再作用于發(fā)光底物，在信號試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號測定儀進(jìn)行發(fā)光測定，酶的濃度決定了化學(xué)發(fā)光的強度。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)為化學(xué)發(fā)光酶免疫分析常用的標記酶，發(fā)光底物以魯米諾、AMPPD為代表。
| 發(fā)光物質(zhì) | 激活酶 | 特點(diǎn) |
| 魯米諾及其衍生物 | HRP |
閃光型，在使用增強劑的情況下，發(fā)光的持續時(shí)間可延到30~60min，強度至少增加100倍以上。 通常采用Luminol/H2O2/HRP體系，化學(xué)發(fā)光反應2min后，光反射強度達到最高峰；20min后，光強度減少20% |
| AMPPD | ALP | 在堿性環(huán)境下，AMPPD本底低； 熱穩定性好，在pH=7.0的水中，30℃時(shí)的分解半衰期為142h； 發(fā)光為輝光型，波長(cháng)為470nm，在15min時(shí)強度達到高峰，15~60min內光信號強度維持一致，變化很??； 加入增強劑能明顯增強發(fā)光強度，達100~100,000倍 |
魯米諾+HRP發(fā)光體系
HRP-CLEIA體系具有發(fā)光時(shí)間短(幾秒內瞬時(shí)閃光)，發(fā)光強度低、不易測量等缺點(diǎn)，為了解決這一問(wèn)題，通常在發(fā)光系統中加入發(fā)光增強劑。發(fā)光增強劑主要作用為放大光輸出，增強光信號，提高發(fā)光持續性，從而提高分析靈敏度和可重復性。
該分析系統采用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標記抗體，在與反應體系中的待測標本和固相載體發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶（HRP）標記抗體復合物，這時(shí)加入魯米諾發(fā)光劑、H2O2和化學(xué)發(fā)光增強劑使產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。
ALP+AMPPD發(fā)光體系
堿性磷酸酶(ALP)和1，2-二氧環(huán)己烷構成的發(fā)光體系是目前最重要、最靈敏的化學(xué)發(fā)光體系，其中最具代表性的是ALP-AMPPD發(fā)光體系。該反應體系以堿性磷酸酶標記抗體，在與反應體系中的待測標本和固相載體發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標記抗體復合物，這時(shí)加入AMPPD發(fā)光劑，堿性磷酸酶使AMPPD脫去磷酸根基團而發(fā)光。
電化學(xué)發(fā)光免疫分析
在電極上施加一定的電壓或電流時(shí)，在電極電化學(xué)反應產(chǎn)物之間或電極反應產(chǎn)物與溶液中某種組分之間發(fā)生化學(xué)反應而產(chǎn)生激發(fā)態(tài)，當激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)時(shí)放出能量，此過(guò)程即為電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)。電化學(xué)發(fā)光免疫分析(electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA)是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標記抗體，以三丙胺(TPA)為電子供體，在電場(chǎng)中因電子轉移而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光反應，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過(guò)程。
在電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統中，磁性微粒為固相載體包被抗體，用三聯(lián)吡啶釕標記抗體，在反應體系內待測標本與相應的抗體發(fā)生免疫反應后，形成磁性微粒包被抗體-待測抗原-三聯(lián)吡啶釕標記抗體復合物，這時(shí)將上述復合物吸入流動(dòng)室，同時(shí)引入TPA緩沖液。當磁性微粒流經(jīng)電極表面時(shí)，被安裝在電極下面的電磁鐵吸住，而未結合的標記抗體和標本被緩沖液沖走。與此同時(shí)電極加壓，啟動(dòng)電化學(xué)發(fā)光反應，使三聯(lián)吡啶釕和TPA在電極表面進(jìn)行電子轉移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光，光的強度與待測抗原濃度成正比。
三種化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的比較
| 直接化學(xué)發(fā)光 | 酶促化學(xué)發(fā)光 | 電化學(xué)發(fā)光 | |
| 標記物 | 吖啶酯 | HRP | 三聯(lián)吡啶釕 |
| 反應類(lèi)型 | 夾心法、競爭法 | 夾心法、競爭法 | 夾心法、競爭法 |
| 光信號 | 閃光 | 輝光 | 電激發(fā)閃光 |
| 簡(jiǎn)便快速 | 快速 | 較快速 | 快速 |
| 影響結果的因素 | 少 | 較多 | 少 |
| 可否半自動(dòng)開(kāi)放 | 否 | 可以 | 否 |
| 檢測成本 | 高 | 低 | 高 |
| 發(fā)光底物 | NaOH | 金剛烷、普米諾 | 電激發(fā) |
化學(xué)發(fā)光、時(shí)間分辨熒光、酶免疫分析對比
| 化學(xué)發(fā)光 | 時(shí)間分辨熒光 | 酶免疫分析 | |
| 示蹤物 | 吖啶酯、酶、三聯(lián)吡啶釕 | 無(wú) | 酶 |
| 測量信號 | 單光子 | 熒光 | 比色 |
| 最小檢出值 | 10-15mol | 10-15mol | 10-9mol |
| 可否提高靈敏度 | 可以 | 可以 | 難 |
| 完成操作流程 | 快 | 快 | 慢 |
| 成本 | 高 | 較高 | 低 |
| 試劑盒有效期 | 半年到更長(cháng) | 1年 | 半年 |
臨床應用
CLIA具有特異性強、靈敏度高、準確、操作簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn)，它將化學(xué)分析方法和免疫學(xué)分析方法的優(yōu)點(diǎn)融合了起來(lái)，已經(jīng)被廣泛用于生命科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、臨床醫學(xué)和生理學(xué)等領(lǐng)域。常見(jiàn)的臨床醫學(xué)應用有：
甲狀腺激素檢測；
生殖激素檢測；
垂體激素和皮質(zhì)激素檢測；
貧血因子檢測；
腫瘤標志物檢測；
感染性標志物檢測；
感染性疾??；
糖尿病、胰島素、血清C-肽、血漿胰高糖素等；
心臟標志物檢測；
病毒標志物檢測；
過(guò)敏性疾??；
治療藥物檢測；
相關(guān)產(chǎn)品
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