兔單克隆抗體開(kāi)發(fā)技術(shù)研究進(jìn)展

單克隆抗體由于其高特異性和親和力而廣泛用于治療、診斷和生物學(xué)應用領(lǐng)域。目前，大多數針對人類(lèi)抗原的單克隆抗體（mAb）是在小鼠體內產(chǎn)生的，小鼠單克隆抗體（MMA）已在診斷和治療環(huán)境中得到廣泛應用。然而，已經(jīng)報道了使用MMA作為人類(lèi)免疫治療劑的許多弊端，包括血清半衰期短和誘導人類(lèi)抗小鼠抗體反應。此外，許多人類(lèi)免疫原無(wú)法刺激小鼠產(chǎn)生抗體反應。這些缺點(diǎn)限制了MMA在治療和診斷應用中的使用。

與傳統的MMA相比，兔單克隆抗體更適合用于研究和診斷。兔單克隆抗體表現出多種綜合優(yōu)勢，包括對抗原的高親和力、特異性、更多樣化的表位識別，以及對小尺寸表位和小鼠抗原反應的大幅改善。此外，兔子在進(jìn)化上與小鼠相距甚遠，兔子可以針對某些在小鼠體內沒(méi)有免疫原性的抗原產(chǎn)生抗體。這些優(yōu)勢使兔單克隆抗體成為人類(lèi)疾病小鼠模型中極具吸引力的診斷試劑。與小鼠mAb類(lèi)似，兔mAb也顯示出一些局限性，包括在人類(lèi)中誘導免疫原性。為了降低免疫原性并促進(jìn)兔單克隆抗體用于治療應用，嵌合化、人源化和Fc工程等抗體工程方法被成功應用。之前的兩項研究表明，人源化兔單抗保留了對人類(lèi)抗原的高特異性和親和力，可用于診斷應用。此外，兔單克隆抗體和MMA對幾種腫瘤類(lèi)型的比較研究表明，兔單克隆抗體顯示出更高的靈敏度，而沒(méi)有明顯的特異性損失。因此，兔免疫系統是產(chǎn)生針對人類(lèi)抗原的治療性人抗體的重要來(lái)源，兔單克隆抗體在藥物和診斷中具有高親和力和特異性的優(yōu)勢。隨著(zhù)抗體功能和庫分析的進(jìn)步，人源化兔單克隆抗體未來(lái)將在治療應用中得到廣泛應用。

獨特的兔抗體庫發(fā)育機制

兔免疫系統產(chǎn)生抗體多樣性，并通過(guò)與小鼠和其他嚙齒動(dòng)物不同的機制優(yōu)化親和力。與傳統鼠單克隆抗體相比，兔單克隆抗體在診斷方面具有優(yōu)勢，對抗原的親和力和特異性高，表位識別更多樣化，對小表位和小鼠抗原的反應大幅提高。兔免疫球蛋白重鏈（IGH）基因座包含200多個(gè)IGH可變種系基因，其中超過(guò)50%被發(fā)現是“無(wú)功能的”。此外，通過(guò)基因組測序（IMGT數據庫）鑒定了超過(guò)50個(gè)IG Kappa V和17個(gè)IG Lambda V功能基因。大多數兔抗體源自IGHV1基因，雖然兔VH庫的多樣性有限，但VL庫比小鼠和人類(lèi)更多樣化。兔VL庫顯示出比其人類(lèi)和小鼠更長(cháng)的互補決定區（CDR）-L3環(huán)。

最近，使用二代測序（NGS）技術(shù)分析了全面的兔抗體庫。在這項研究中，發(fā)現IGHV1S40和IGHV1S45主導了幼兔的VH庫，而IGHV1S69對用16聚體肽免疫的兔有顯著(zhù)貢獻。此外，兔VH和VL的體細胞突變高于人類(lèi)和小鼠，VH區域比人類(lèi)和小鼠多三分之二的突變，而VL區域在片段區域（FR）-1和FR-3中積累的突變更多。兔CDR-H3的平均長(cháng)度為12個(gè)氨基酸，與人類(lèi)和小鼠相似，而CDR-L3的長(cháng)度比人類(lèi)和小鼠長(cháng)得多。兔免疫系統同時(shí)使用基因轉換和體細胞超突變來(lái)使抗體庫多樣化，與人類(lèi)和小鼠相比，兔抗體庫中的更多突變可以彌補用于構建功能庫種系基因的限制。

兔單克隆抗體開(kāi)發(fā)技術(shù)

單克隆抗體（mAb）是生物化學(xué)、分子生物學(xué)和醫學(xué)研究中必不可少的工具。mAb療法以越來(lái)越快的速度徹底改變了許多嚴重人類(lèi)疾病的方法，在過(guò)去的十年中，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出許多用于分離兔單克隆抗體的技術(shù)。

2017年初，超過(guò)230種mAb在階段臨床研究中得到評估。存在許多用于研究和治療目的的mAb生成和鑒定方法。1975年Kohler和Milstein描述的小鼠雜交瘤方法是第一個(gè)也是最廣泛使用的獲得小鼠mAb的方法。在過(guò)去的幾十年中，噬菌體展示、酵母表面展示、核糖體展示和mRNA展示技術(shù)已被用于生產(chǎn)mAb。盡管這些抗體生成技術(shù)被廣泛用于mAb篩選，但這些方法效率低下且需要耗時(shí)的操作。此外，抗體的天然同源配對信息在展示方法中丟失，降低了抗體的特異性多樣性。

最近，開(kāi)發(fā)了一種基于單B細胞的方法，從單個(gè)B細胞或單細胞的克隆擴增后代直接取樣免疫組庫，避免了低效的雜交瘤融合步驟，并保留了天然的重鏈和輕鏈配對。此外，該技術(shù)利用了mAb的親和力、特異性和穩定性特征的天然過(guò)程。通過(guò)FACS或手動(dòng)顯微操作從抗原特異性記憶B細胞或漿細胞，抗體基因被轉移到原核、真核或無(wú)細胞表達系統中，表達重組兔單克隆抗體。單B細胞抗體技術(shù)平臺已被證明是高效和穩健的，可以在短時(shí)間內從免疫兔中產(chǎn)生大量抗原特異性重組抗體，從而促進(jìn)了兔單克隆抗體的生產(chǎn)。

1.雜交瘤技術(shù)

小鼠雜交瘤技術(shù)依賴(lài)于B細胞與骨髓瘤伴侶的細胞融合，自1975年被鑒定以來(lái)，廣泛地用于小鼠單克隆抗體的生產(chǎn)（圖1）。該方法采用免疫小鼠的淋巴細胞與源自BALB/c小鼠的骨髓瘤細胞融合，形成永生化雜交瘤細胞。然后，篩選雜交瘤細胞以鑒定產(chǎn)生相同抗體的特定克?。▓D1）。兔單克隆抗體于1988年首次報道，采用小鼠-兔異源雜交瘤方法。然而，這種小鼠-兔異源雜交瘤效率相對較低、不穩定，并且無(wú)法長(cháng)時(shí)間分泌抗體。在20世紀90年代中期，產(chǎn)生了穩定的兔-兔雜交瘤以生產(chǎn)兔單克隆抗體。這些兔-兔雜交瘤也被證明不如傳統的小鼠雜交瘤穩定，這限制了它們在實(shí)驗室水平上的廣泛使用。此外，由于低效融合（傳統聚乙二醇融合的效率為5×10^-6）和轉化事件，雜交瘤技術(shù)在兔單克隆抗體生產(chǎn)中的應用受到限制。

注：（A）小鼠雜交瘤技術(shù)；（B）噬菌體展示技術(shù)；（C）單B細胞抗體技術(shù)。

圖1. 抗原特異性單克隆抗體開(kāi)發(fā)流程

雜交瘤技術(shù)是一種成熟的小鼠單克隆抗體生成方法，廣泛用于生產(chǎn)各種抗體。由于缺乏合適的骨髓瘤伴侶，雜交瘤方法主要限于嚙齒動(dòng)物免疫。在20世紀80年代，開(kāi)發(fā)了一種用于生產(chǎn)治療性抗體的人類(lèi)雜交瘤技術(shù)，該技術(shù)允許以天然形式產(chǎn)生天然人類(lèi)抗體。這種人類(lèi)雜交瘤技術(shù)開(kāi)發(fā)了另一種無(wú)需額外修飾即可產(chǎn)生治療性抗體的有效方法。許多研究致力于這項技術(shù)，并發(fā)現了幾種有用的人類(lèi)融合伴侶細胞系?；诟玫娜诤习閭H的開(kāi)發(fā)和電融合技術(shù)的進(jìn)步，人類(lèi)雜交瘤融合的成功率得到提高，這可以在不久的將來(lái)促進(jìn)治療性抗體的開(kāi)發(fā)。此外，有一種基因修飾方法，通過(guò)過(guò)度表達BCL-6和BCL-XL使人類(lèi)B細胞永生化。使用這項技術(shù)分離出了許多針對多種致病病毒的單克隆抗體。該技術(shù)還成功應用于其他物種，從永生化記憶B細胞中高效生成了兔單克隆抗體。

2.噬菌體展示技術(shù)

從1990年代初開(kāi)始，噬菌體展示技術(shù)被探索為一種產(chǎn)生mAb的新方法。在這種方法中，從淋巴細胞中收集V基因庫，并通過(guò)融合到絲狀噬菌體的外殼蛋白來(lái)克隆和表達VH和VL的組合（圖1）。然后，選擇在其尖端帶有表達的特定mAb的噬菌體顆粒并將其用于常規測定。與雜交瘤技術(shù)相比，噬菌體展示已成功用于篩選和分離免疫球蛋白基因。2000年，Rader等人。首先描述了用噬菌體展示技術(shù)篩選兔單克隆抗體的全過(guò)程。該技術(shù)成功地用于針對結腸癌免疫治療的靶抗原人A33抗原的兔抗體的篩選和人源化，獲得的人源化抗體對人A33抗原具有高度特異性和親和力。目前，抗體噬菌體展示因其抗體生成速度快、易于制作以及體外控制各種選擇參數的能力，成為了產(chǎn)生用于治療目的的全人源抗體的主要技術(shù)平臺。

基于對抗體結構、功能和序列多樣性的了解，人類(lèi)還開(kāi)發(fā)了一種新的合成抗體庫技術(shù)，并將其用于mAb生產(chǎn)，方法是將精確設計的序列插入抗原結合位點(diǎn)。這項技術(shù)是基于基因復制IgG片段和使用分子生物學(xué)技術(shù)在體外使抗體互補位多樣化來(lái)實(shí)現的。幾個(gè)具有多個(gè)可變重鏈和輕鏈框架區的合成抗體文庫（例如HuCAL和Ylanthia文庫）被設計并用于分離針對分子識別優(yōu)化的人單克隆抗體。隨著(zhù)文庫設計和選擇方法的進(jìn)步，合成抗體文庫將成為快速生成具有高特異性的靶向結合單克隆抗體不可或缺的工具。

3.單B細胞抗體技術(shù)

盡管雜交瘤篩選和顯示方法已用于兔單克隆抗體生產(chǎn)，但它們都存在一些缺點(diǎn)：雜交瘤技術(shù)細胞融合效率低，而展示方法導致重鏈和輕鏈的天然同源配對丟失。為了克服這些問(wèn)題，最近開(kāi)發(fā)了單B細胞抗體技術(shù)（圖1）。簡(jiǎn)而言之，單B細胞抗體技術(shù)包括以下簡(jiǎn)短步驟：（i）通過(guò)隨機方式或FACS從外周血或淋巴組織中鑒定和分離特定的單B細胞，（ii）單細胞逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）使用抗體特異性引物，（iii）使用PCR和測序擴增Ig基因，（iv）將Ig基因克隆到表達載體中，（v）Ig基因在細菌系統（例如大腸桿菌）中表達或哺乳動(dòng)物細胞系統（例如HEK293、CHO細胞），以及（vi）純化蛋白質(zhì)并使用酶聯(lián)免疫吸附測定法進(jìn)行評估（圖1）。這種方法已廣泛用于人和小鼠單克隆抗體的生產(chǎn)，并產(chǎn)生了一些治療性中和單克隆抗體，用于治療多種疾病，包括癌癥、自身免疫性疾病和傳染病。例如，使用單B細胞抗體技術(shù)從HIV患者中分離出幾種有價(jià)值的mAb用于臨床診斷。這種方法最重要的優(yōu)點(diǎn)是保留了重鏈和輕鏈的天然同源配對，利用抗體親和力、特異性和成熟的自然過(guò)程。該技術(shù)有利于生成更高親和力、特異性和穩定性的mAb。

記憶B細胞和漿/漿母細胞是產(chǎn)生抗體的主要來(lái)源。在人、小鼠和兔子的單B細胞抗體分析中采用的大多數方法都集中在記憶B細胞或漿/漿母細胞上。Kurosawa等人開(kāi)發(fā)了一種基于內質(zhì)網(wǎng)（ER）的方法，用于使用FACS和ER特異性熒光染料鑒定和分離抗原特異性血漿/漿母細胞。該方法提高了血漿/漿母細胞的選擇效率，并消除了細胞繁殖和篩選過(guò)程。此外，Ozawa等人開(kāi)發(fā)了一種芯片上的免疫斑點(diǎn)陣列測定技術(shù)來(lái)檢測兔抗原特異性mAb，并且該技術(shù)可以產(chǎn)生特異性識別人轉化生長(cháng)因子-β-激活激酶1的磷酸化位點(diǎn)特異性表位的兔mAb。Clargo等人報道了一種基于熒光的方法與顯微操作相結合，以分離兔單抗原特異性IgG分泌漿細胞，用于抗體表達分析。此外，Seeber等人使用淋巴細胞淘選捕獲抗原特異性B細胞，結合體外B細胞短期培養和B細胞克隆，從外周血中分離功能性兔單克隆抗體。

兔淋巴細胞的分離由于缺乏有用的表面標志物而受到限制。為了選擇稀有且特異性的兔B細胞進(jìn)行mAb表達，開(kāi)發(fā)了幾種新方法。最近，Starkie等人描述了一種雙色抗原染色法，用于鑒定抗原特異性兔記憶B細胞，有效抗體鑒定率為38.5%。在這項工作中，陰性細胞染色用于消除T細胞、幼稚IgM+B細胞和死細胞，使用抗IgG和雙抗原標記步驟（FITC和PE）進(jìn)行陽(yáng)性細胞染色可以鑒定抗原特異性類(lèi)別轉化的IgG⁺記憶B細胞亞群。這種將FACS技術(shù)與抗原結合步驟相結合，提高了抗原特異性mAb的回收率，因此具有高通量。此外，還開(kāi)發(fā)了另一種簡(jiǎn)單靈活的方法HybriFree，并成功用于小鼠、兔和雞mAb的生產(chǎn)。HybriFree工作流程包括四個(gè)步驟：用裝載抗原的固體基質(zhì)捕獲抗原特異性B細胞、VH和VL編碼cDNA的單細胞擴增、在哺乳動(dòng)物表達系統中構建組合VH-VL文庫以及確定合適的VH-VL組合。該方法在10天內成功用于兔抗小鼠CD48單克隆抗體的高效制備，適用于任何抗體cDNA序列可用的物種。另一種用于兔mAb生產(chǎn)的稱(chēng)為“單細胞RT-PCR連接體外表達（SICREX）”的新型篩選平臺。在這項工作中，通過(guò)顯微操作結合抗原偶聯(lián)磁珠分離抗原特異性B細胞，并使用線(xiàn)性Ig表達盒擴增Ig基因以實(shí)現無(wú)細胞生產(chǎn)。線(xiàn)性表達盒包含轉錄和翻譯調控的所有必需元件，包括T7啟動(dòng)子和T7終止子，抗原結合片段或單鏈可變片段無(wú)需克隆即可表達。與之前的平臺相比，SICREX的整個(gè)過(guò)程都是在體外進(jìn)行的，將mAb生產(chǎn)時(shí)間縮短到幾天。

最近，基于質(zhì)譜（MS）的從頭測序方法已被用于從血清來(lái)源的多克隆抗體庫中鑒定純化的mAb，這促進(jìn)了血清Ig的蛋白質(zhì)組學(xué)反卷積的發(fā)展。結合NGS和MS技術(shù)的進(jìn)步，該方法成功地用于測定兔免疫后多克隆血清反應的抗體組成。在這種方法中，全長(cháng)血清IgG被純化并用胃蛋白酶處理以制備F（ab）₂片段，然后抗原特異性F（ab）₂分離片段并進(jìn)行蛋白水解消化，用于液相色譜高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）。同時(shí)，通過(guò)NGS測序構建抗體庫數據。通過(guò)抗體數據庫作圖，鑒定出單個(gè)mAb。

參考文獻

Zhang Z, Liu H, Guan Q, et al. Advances in the isolation of specific monoclonal rabbit antibodies[J].Front. Immunol, 8: 494.

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