新型冠狀病毒（2019-nCoV）檢測方法介紹-核酸檢測
冠狀病毒是一類(lèi)具有包膜、基因組為線(xiàn)性單股正鏈的RNA病毒。人體感染冠狀病毒后通常引起感冒、發(fā)燒等癥狀，嚴重者能造成死亡。2020年1月于武漢發(fā)現的新型冠狀病毒（2019-nCoV）是目前發(fā)現的第七種能夠感染人類(lèi)的冠狀病毒。判定人體是否感染冠狀病毒通常有三種途徑，分別是對冠狀病毒的編碼基因（RNA）進(jìn)行檢測、對冠狀病毒基因表達的特定蛋白（如Spike蛋白）進(jìn)行檢測以及對冠狀病毒侵入人體后產(chǎn)生的IgG/IgM進(jìn)行檢測。本文主要對2019-nCoV核酸檢測的原理及方法做一介紹。
檢測原理
冠狀病毒的編碼基因是RNA，通過(guò)測定樣本中是否含有新型冠狀病毒基因，即可判斷患者是否被感染。RNA檢測主要依賴(lài)于逆轉錄實(shí)時(shí)熒光PCR（RT-PCR）技術(shù)。
逆轉錄實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)
PCR的全稱(chēng)為聚合酶鏈式擴增技術(shù)，是一種用于放大擴增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，能夠實(shí)現微量DNA片段的大幅擴增。其基本原理是先將雙鏈DNA解鏈為單鏈，隨后以單鏈DNA為模板，借助人工合成的一段核酸片段（引物）來(lái)??? 啟動(dòng)合成，最終合成新的雙鏈DNA。在PCR反應體系中，DNA雙螺旋被解鏈成單鏈后，引物與單鏈DNA的特定序列結合，形成一小段的雙鏈DNA，隨后在合適的溫度下進(jìn)行延伸，形成新的雙鏈DNA。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，核酸數量就會(huì )增加1倍，經(jīng)過(guò)28-35個(gè)循環(huán)，即可將微量的核酸片段變的肉眼可見(jiàn)。
由于2019-nCoV的編碼基因為RNA，因此需要先將RNA逆轉錄為cDNA，隨后進(jìn)行PCR擴增，該技術(shù)稱(chēng)為逆轉錄PCR。在逆轉錄PCR反應體系中加入熒光探針，隨著(zhù)PCR的進(jìn)行，反應產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強度信號，通過(guò)熒光信號，實(shí)現對逆轉錄PCR產(chǎn)物（DNA序列）的實(shí)時(shí)監測。
2019-nCoV序列的引物設計
核酸檢測的準確性由引物的特異性決定，引物特異性不高會(huì )導致出現非特異性擴增，最終影響測定結果。目前核酸檢測所使用的引物序列，基本都是針對病毒序列中高度保守的2至3個(gè)序列（比如編碼replicase復制酶或者necleocapsid核蛋白衣的核酸序列）來(lái)進(jìn)行設計。2019-nCoV的引物序列如下圖所示：
檢測步驟
核酸檢測現主要通過(guò)檢測試劑盒實(shí)現，檢測步驟主要分為樣本采集、RNA提取及PCR擴增三部分。
樣本采集
常規的樣本類(lèi)型包括咽拭子、鼻拭子、痰液、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液等，依據試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行樣本的采集。獲得樣本后需盡快進(jìn)行檢測。
RNA提取
利用核酸提取試劑盒對RNA進(jìn)行提取，空氣中含有大量的RNA酶，RNA在空氣中極易降解，因此需做好保護措施（如加入能抑制核酸酶活性的物質(zhì)）。在提取得到RNA后需立即進(jìn)行PCR擴增。
PCR擴增
最后將RNA放入PCR反應體系中進(jìn)行擴增，并觀(guān)察擴增結果。擴增后的核酸序列帶有熒光，如果檢測到熒光信號曲線(xiàn)符合病毒特征，那么就認為該疑似患者為陽(yáng)性。在實(shí)際操作過(guò)程中，需對一位患者進(jìn)行多次檢測
提取病毒RNA本身也包含裂解樣本，提純RNA等多個(gè)工序，需要花費數小時(shí)。而RT-PCR一般來(lái)說(shuō)也需要至少三四個(gè)小時(shí)才能完成。因此整個(gè)流程預計需要一個(gè)工作日，即6-8小時(shí)左右，檢測結果都需要經(jīng)過(guò)復核，重復實(shí)驗則需要花費雙倍的時(shí)間。
檢測特點(diǎn)
核酸檢測是分子層面上的檢測，就現有所有的快速檢測方法來(lái)看，這種方法檢測的特異性和靈敏度都是最高的。由于這一檢測方法靠的是分子層面的特異性結合，因此只要公布的基因序列沒(méi)有問(wèn)題，相關(guān)技術(shù)的檢測準確率可以達到99.9%。
核酸檢測與蛋白檢測方式對比
| 核酸檢測 | 蛋白檢測 | |
| 準確性 | 依賴(lài)于引物的特異性 | 依賴(lài)于抗體的親和力 |
| 待測物 | RNA | 蛋白 |
| 操作 | 需要提取RNA，流程繁瑣 | 血清檢測，流程簡(jiǎn)單 |
| 周期 | 長(cháng)，需要6-8h | 短，只需15-30min |
| 試劑盒開(kāi)發(fā)難度 | 難度小，開(kāi)發(fā)周期短 | 需獲得特異性抗體，難度大，開(kāi)發(fā)周期長(cháng) |
| 試劑盒生產(chǎn)成本 | 低 | 高 |
| 試劑盒用途 | 新冠肺炎篩查確診 | 與核酸檢測聯(lián)合使用，降低假陰性 |
參考文獻
[1]. Lu H, Stratton CW, Tang YW. Outbreak of pneumonia of unknown etiology in Wuhan China: the mystery and the miracle. J Med Virol 2020; published online Jan 16. DOI:10.1002/jmv.25678.
[2]. 耿合員, 譚文杰. 新近發(fā)現的冠狀病毒研究進(jìn)展[J]. 病毒學(xué)報, 2013(1):65-70.
[2]. 趙煥英, 包金風(fēng). 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理及其應用研究進(jìn)展[J]. 中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志, 2007, 16(4):492-497.
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